王雯君+林曦+童夏生+王恩智+叶辉+叶乐平
[摘要] 意图 评论核苷酸结合寡聚域（NOD）样受体在哮喘发病机制中的效果。 办法 选用哮喘大鼠模型别离提纯血中性粒细胞（PMN），实时荧光定量PCR法检测PMN NOD2和NALP1 mRNA的表达。 成果 哮喘组NOD2 mRNA的表达量（3.11±0.82）明显高于对照组（P<0.01），地塞米松组NOD2 mRNA的表达量（1.30±0.28）明显低于哮喘组（P<0.01）。哮喘组NALP1 mRNA的表达量（0.51±0.21）明显低于对照组（P<0.01），地塞米松组NALP1 mRNA的表达量（0.91±0.26）明显高于哮喘组（P<0.05）。血PMN NOD2和NALP1 mRNA 的表达水平呈明显负相关性（n=24，r=-0.74，P<0.01）。 定论 哮喘大鼠血PMN NOD2 mRNA的表达升高，NALP1 mRNA的表达则相反，地塞米松具有调理模式辨认受体的效果。
[关键词] 哮喘；模式辨认受体；NOD样受体；地塞米松；发病機制
[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）28-0039-03
哮喘的发病机制十分复杂，触及多种炎症细胞和炎症因子[1]，嗜酸性粒细胞被以为是最首要的炎症细胞之一[2]。中性粒细胞（polymorphonuclear，PMN）也是很多炎症细胞中的一种，尤其在非嗜酸性粒细胞表型的哮喘、糖皮质激素医治不灵敏和重度哮喘中PMN所起的效果越来越被人们所注重[3，4]。在哮喘急性期，PMN被激活，它能排泄多种炎症因子和蛋白酶类参加哮喘的炎症机制[3，4]，但其参加哮喘炎症的机制至今没有彻底清楚。模式辨认受体是一类介导天然免疫和继发性免疫的辨认受体，现在以为模式辨认受体与哮喘的炎症机制密切相关[5]。核苷酸结合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）2和NALP（NACHT、LRR和PYD domains-containing protein，NALP）均归于NOD样受体宗族成员，为细胞内模式辨认受体，参加细胞内信号传导，与机体的抗感染、肿瘤、关节炎和炎症性肠病等多种疾病的发病机制有关[6，7]。但NOD样受体宗族在哮喘炎症机制中的效果怎么现在知之甚少。本研讨经过调查哮喘大鼠PMN NOD2和NALP1的表达，评论哮喘的发病机制，为哮喘的防治供给理论依据。
1 材料与办法
1.1 一般材料
清洁级健康雄性SD大鼠24只，4～5周龄，均匀128 g，由杭州师范大学动物试验中心供给，试验动物合格证号：SCXK（浙）20140001。
1.2 首要试剂
Ⅴ级鸡卵白蛋白（ovalbumin，OVA）和Histopaque 1119及1083别离液均购自美国Sigma公司。
1.3 分组及模型制备
大鼠养殖于杭州师范大学动物试验中心，自在进食和饮水，温度20℃，湿度50%。共24只，随机均匀分为三组，命名为哮喘组、对照组、地塞米松组。选用OVA致敏的办法仿制哮喘模型[8]。具体办法为：第1天和第8天腹腔打针OVA/氢氧化铝混合液2 mL（含OVA 1 mg和氢氧化铝100 mg）致敏，各1次。第15天开端每天向大鼠喷雾（空气压缩雾化器：德国百瑞公司出产）1% OVA 30 min，接连激起14 d。地塞米松组在OVA雾化激起开端前一天至雾化完毕止，每日1次给予腹腔打针地塞米松1 mg/只，共15 d。哮喘大鼠首要症状为搔痒、抓鼻、烦躁、喘鸣、呼吸加速、腹肌抽搐、毛发逐突变黄及无光泽等。
1.4 血PMN别离提纯和肺安排标本的制备
末次激起24 h后，水合氯醛腹腔打针麻醉，心脏抽血4 mL，选用Histopaque别离液行密度梯度离心，别离提纯血PMN[9]，0.1M PBS洗刷，台盼蓝查细胞生机，瑞氏染色查PMN纯度为90%。取左肺门安排，多聚甲醛固定、切片、HE染色，光镜下调查肺安排病理改动。
1.5 Rt-PCR法检测血PMN NOD2和NALP1 mRNA的表达
选用Trizol-离心柱法提取总RNA，然后转录成cDNA。测定RNA的反响系统（购自上海捷瑞生物工程有限公司）共20 μL，25℃干浴5 min、42℃干浴60 min、70℃干浴5 min停止反响，-80℃保存cDNA。20 μL反响液为：特异性PCR引物各0.3 μL、cDNA模板2 μL、灭菌超纯水7.4 μL、SYBR 10 μL。95℃15 min、95℃ 10 s、60℃ 20 s、72°C 20 s（39循环），增量0.5°C 10 s。基因序列见表1，成果剖析选用比较CT值法：△△CT=（CTNOD2/NALP1-CTβ-actin）试验组-（CTNOD2/NALP1-CTβ-actin）对照组，基因相对表达量（RQ）选用2-△△CT办法核算。
1.6 统计学办法
选用SPSS16.0统计学软件，计量材料以均数±规范差（x±s）标明，Homogeneity of Variances行方差齐性剖析，多组间比较选用秩和查验，两变量相关剖析选用直线相关剖析法，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 肺安排病理变化
HE染色显现：哮喘组见黏液腺增生，支气管腔见较多黏液排泄物，部分担腔有黏液栓，支气管上皮细胞增生，较多炎性细胞滋润，支气管腔旁见集合的淋巴细胞。对照组肺安排细胞明晰，结构完好，炎症细胞和支气管腔内排泄物少。地塞米松组肺安排炎症细胞和炎症排泄物较哮喘组削减（封三图1）。
2.2 血PMN NOD2和NALP1 mRNA的表达
抽提物总RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之间，意图基因NOD2、NALP1及内参基因β-actin的溶解曲线均为单一峰，基因扩增曲线呈规范S型，溶解温度依次为90.5℃、79℃、87℃。NOD2和NALP1 mRNA的表达量均方差不齐，选用秩和查验。
哮喘组NOD2 mRNA的表达量明显高于对照组（P<0.01），地塞米松组NOD2 mRNA的表达量明显低于哮喘组（P<0.01）。哮喘组NALP1 mRNA的表达量明显低于对照组（P<0.01），地塞米松组NALP1 mRNA的表达量明显高于哮喘组（P<0.05）（表2）。
2.3 相关性剖析
血PMN NOD2和NALP1 mRNA 的表达水平呈明显直线负相关（n=24，r=-0.74，P<0.01）。
3 评论
先天免疫系统是机体的第一道防地，经过模式辨认受体对病原体作出快速应对。人类的模式辨认受体首要有两类：一类是膜结合受体，如Toll样受体；另一类是细胞内的模式辨认受体，包括NOD样受体和具有螺旋酶结构域的抗病毒蛋白受体[10]。现在的研讨标明，Toll样受体与哮喘的发病机制密切相关，重度哮喘患者支气管平滑肌TLR5和TLR7的表达下降[11]，哮喘患者血調节性T淋巴细胞TLR2和TLR4的表达也下降[12]。NOD样受体宗族是细胞内的模式辨认受体，包括NOD2和NALP1，NOD1和NOD2是NOD样受体宗族最具有代表性的亚型，NOD样受体与多种肺部急、缓慢炎症性疾病有关，如肺炎、缓慢阻塞性肺疾病、肺损害、肺尘病、哮喘等[13，14]。
本研讨提示，大鼠哮喘各组血PMN均有NOD2和NALP1 mRNA的表达，证明了模式辨认受体可在血PMN细胞中表达，PMN可能经过表达模式辨认受体在机体中起到必定的病理或生理效果。一起本研讨发现，不同的模式辨认受体所表达的水平不同，NOD2 mRNA的表达量明显高于对照组，而NALP1 mRNA的表达则相反，标明它们所起的效果可能也不同。经过相关剖析发现，NOD2和NALP1 mRNA的表达呈明显负相关，提示不同类型的模式辨认受体之间的表达具有必定的内在联系，一起参加机体的免疫进程。本文估测，在OVA诱发的哮喘模型中，因为PMN的NOD2 mRNA的表达过多及NALP1 mRNA的表达缺乏一起触及了哮喘的炎症机制。国内类似的研讨也发现，哮喘大鼠肺安排和哮喘患者的趋化因子CCR3阳性的粒细胞中NOD2蛋白的表达均下降[15，16]。这与本研讨成果有差异，可能NOD2在不同的安排中表达不同，也可能是NOD2的蛋白与基因之间表达不一致。
现在以为，以NOD样受体为医治靶点，挑选性地按捺其表达可能有利于医治多种急缓慢疾病[17]。糖皮质激素是医治哮喘的最有用的药物，具有按捺炎症因子开释的效果，在临床上广泛运用[18-20]。本研讨成果发现，地塞米松组血PMN NOD2 mRNA的表达水平低于哮喘组，且NALP1 mRNA的表达量高于哮喘组，提示地塞米松具有下调NOD2 mRNA的表达和上调NALP1 mRNA的表达，然后起到减轻哮喘炎症的效果。
综上，哮喘大鼠血PMN NOD2 mRNA的表达升高，NALP1 mRNA的表达则相反，地塞米松具有调理模式辨认受体的效果。
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（收稿日期：2016-07-05）
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