左凯++薛栋++孔丽++夏修良
[摘要]意图 探討肝癌安排中富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）、Twist和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达及临床含义。办法 搜集滨州市人民医院2006年2月～2012年2月手术切除的80例肝癌安排标本作为研讨目标，其间配对癌旁安排（间隔癌安排边际<3 cm）50例。选用免疫组化EnVision法检测Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白的表达，并剖析其与临床病理特征和侵袭搬运的联系。成果 Pyk2在肝癌安排及癌旁肝安排中的阳性表达率别离为71.3%、12.0%，差异有统计学含义（P<0.05）；Twist在肝癌安排及癌旁肝安排中的阳性表达率别离为66.3%、6.0%，差异有统计学含义（P<0.01）；E-cadherin在肝癌安排及癌旁肝安排中的阳性表达率别离为27.5%、90.0%，差异有统计学含义（P<0.01）。Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白阳性表达与肝癌病理分级、分解程度、血管侵略及TNM分期均显着相关（P<0.05），肝癌安排中，Pyk2与Twist表达到正相关（P<0.05），Pyk2和E-cadherin表达到负相关（P<0.05），Twist和E-cadherin表达也成负相关（P<0.05）。定论 Pyk2、Twist及E-cadherin一起参加了肝癌的发作、开展，Pyk2可能经过上调Twist的表达促进肝癌侵袭搬运。
[要害词]肝细胞癌；富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2；Twist；E-钙黏蛋白；免疫安排化学
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（a）-0004-04
[Abstract]Objective To explore the expressions of Pyk2，Twist and E-cadherin in hepatocellular carcinoma and their clinical significance.Methods 80 hepatocellular carcinoma tissues in our hospital from February 2006 to February 2012 were selected as the research objects，and 50 cases of adjacent paracancerous tissues were matched （from the edge of cancer tissue to less than 3 cm）.Immunohistochemistry of EnVision was used to detect the expression of Pyk2，Twist and E-cadherin in hepatocellular carcinomas and adjacent paracancerous tissues.The correlation between their expression and pathologic parameters were analyzed by statistics.Results The positive rate of Pyk2 in hepatocellular carcinomas was significantly higher than that in adjacent paracancerous tissues，with significant difference （71.3% vs. 12.0%，P<0.05）.Significant differences were also observed in the positive expression rate of Twist between the patients with hepatocellular carcinomas and paracancerous tissues （66.3% vs. 6.0%，P<0.01）.The positive rate of E-cadherin in hepatocellular carcinomas was significantly lower than that in adjacent paracancerous tissues （27.5% vs. 90.0%，P<0.01）.The positive expression of Pyk2，Twist，E-cadherin was significantly correlated with pathological grade，degree of differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage （P<0.05）.The expression of Pyk2 was positively correlated with the expression of Twist in hepatocellular carcinoma （P<0.05），the expression of Pyk2 was negatively correlated with the expression of E-cadherin （P<0.05），and the expression of Twist was negatively correlated with the expression of E-cadherin （P<0.05）.Conclusion Pyk2，Twist and E-cadherin protein expression might be associated with the development，invasion，and metastasis of hepatocellular carcinoma.Pyk2 may play a role during invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by up-regulating the expression of Twist.
[Key words]Hepatocellular carcinoma；Proline-rich tyrosine kinase-2；Twist；E-cadherin；Immunohischemistry
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统较常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势。肝癌恶性程度高，前期缺少特异性症状，5年生存率较低[1]。部分肝癌患者确诊时就呈现了肝内搬运、门静脉癌栓乃至远处搬运，失去了手术切除时机，因而，寻觅肝癌前期确诊和临床医治的分子标志物已成为一个亟待解决的问题。富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，是黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）宗族的一个新成员，在肿瘤细胞增殖、侵袭搬运等进程中发挥重要效果[2]。国内外研讨已证明，Pyk2在神经胶质细胞瘤[3]、非小细胞肺癌[4]、膀胱癌[5]等肿瘤安排中高表达，而且与肿瘤分期及搬运密切相关。Twist基因是碱性螺旋-环-螺旋（basic helix loop helix，bHLH）转录因子宗族的一个重要成员，Twist与肿瘤侵袭、搬运密切相关[6]。上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是促进肿瘤细胞侵袭搬运的一个重要机制。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是上皮间质转化的重要标志分子[7]。本研讨选用免疫安排化学EnVision办法评论Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌中的表达及临床肿瘤学含义，旨在为临床靶向医治肝癌供给必定的理论依据。
1材料与办法
1.1一般材料
选取2006年2月～2012年2月滨州市人民医院肝细胞癌手术切除的80例临床标本，其间配对癌旁安排（间隔癌安排边际<3 cm）50例；男性56例，女人24例；年纪33～79岁；53例肿瘤直径<5 cm，27例肿瘤直径≥5 cm。一切标本病理确诊均为原发性肝细胞癌，术前未接受过放、化疗等抗肿瘤医治。临床分期（2010年世界抗癌联盟规范）：Ⅰ、Ⅱ期共51例，Ⅲ、Ⅳ期共29例。
1.2试剂和办法
选取病理科存档的肿瘤安排蜡块，病理科医生从头切片确诊，进一步行病理学分级，别离施行Pyk2、Twist和E-cadherin免疫安排化学染色，使用免疫组化EnVision法检测Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白的表达。兔抗人Pyk2单克隆抗体、兔抗人Twist多克隆抗体及兔抗人E-cadherin多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，作业浓度均为1∶200。EnVision试剂盒购自丹麦Dako公司，操作进程按试剂盒说明书进行。一起设阳性和阴性对照，阳性对照为试剂公司供给的强阳性标本切片，阴性对照选用磷酸盐缓冲溶液替代一抗。
1.3 成果断定
Pyk2蛋白阳性：细胞质内呈现棕黄色或棕褐色颗粒；Twist蛋白阳性：细胞质内呈现棕黄色颗粒；E-cadherin蛋白阳性：细胞膜和（或）细胞质内呈现棕黄色颗粒。在不知任何布景材料的景象下，由两位病理专家选用双盲法进行阅片。首要依据染色强度打分，无染色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分，染色需与布景上色相比较。再将阳性细胞所占的百分比进行打分，无阳性细胞记为0分，阳性细胞所占百分比为1%～25%记为1分，阳性细胞所占百分比为>25%～50%记为2分，阳性细胞所占百分比为>50%～75%记为3分，阳性细胞所占百分比为 >75%～100%记为4分。终究依据染色强度与阳性细胞百分比乘积进行评分，≥4分记为阳性表达，<4分记为阴性表达。
1.4统计学剖析
选用SPSS 13.0统计学软件对数据进行剖析，计数材料选用χ2查验，等级相关查验选用Spearman等级相关剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1肝癌安排及癌旁安排中Pyk2蛋白的表达
Pyk2阳性染色首要坐落细胞质，细胞核未见显着染色，染色为棕黄色或棕褐色，呈小片状或弥漫性散布（图1）。Pyk2在肝癌安排中的阳性表达率为71.3%，在癌旁肝安排中的阳性表达率为12.0%，两种肝安排中的阳性表达率比较，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。
2.2肝癌安排及癌旁安排中Twist蛋白的表达
Twist蛋白的阳性上色坐落细胞质，为棕黄色颗粒（图2）。Twist在肝癌安排中的阳性表达率为66.3%，而在癌旁肝安排的阳性表达率为6.0%，两种肝安排中的阳性表达率比较，差异有统计学含义（P<0.01）（表1）。
2.3肝癌安排及癌旁安排中E-cadherin蛋白的表达
E-cadherin蛋白的阳性上色首要坐落细胞膜或细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒（图3）。E-cadherin在肝癌安排中的阳性表达率为27.5%，而在癌旁肝安排的阳性表达率为90.0%，两种肝組织中的阳性表达率比较，差异有统计学含义（P<0.01）（表1）。
2.4 Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白表达与肝癌临床病理特征的联系
肝癌中Pyk2阳性表达与患者年纪、性别、AFP、肿瘤巨细及包膜完整性无关（均P>0.05），与病理分级、肿瘤分解、血管侵略及临床TNM分期有关（均P<0.05）。肝癌安排中Twist阳性表达与患者年纪、性别、肿瘤巨细、AFP及包膜完整性无关（均P>0.05），与病理分级、肿瘤分解、血管侵略及TNM分期有关（均P<0.05）。肝癌安排中E-cadherin阳性表达与患者年纪、性别、肿瘤巨细、AFP及包膜完整性无关（均P>0.05），与病理分级、肿瘤分解程度、血管侵略及TNM分期有关（均P<0.05）。Pyk2、Twist一起高表达于分解程度低、血管侵略、病理分级较差及分期较晚的肝癌安排中（表2）。
2.4 Pyk2、Twist和E-cadherin在肝癌安排中表达的联系
Spearman等级相关剖析显现，肝癌安排中Pyk2与Twist蛋白表达到正相关（r=0.425，P=0.032），Pyk2与E-cadherin的表达到负相关（r=-0.472，P=0.026）；Twist与E-cadherin的表达也成负相关（r=-0.308，P=0.037）。
3评论
Pyk2是一种富含脯氨酸的非受体酪氨酸蛋白激酶，定坐落人第8号染色体（8 p21.1），基因全长4.048 kbp。Pyk2依赖于钙离子浓度的改变而被激活，调控细胞增殖、分解及侵袭[8-10]。Pyk2能诱导乳腺癌细胞发作上皮间质转化，促进肿瘤细胞侵袭和搬迁[11]。本研讨成果显现，Pyk2在肝癌安排中高表达，在肝癌安排中的阳性表达率显着高于癌旁肝安排（P<0.05），提示Pyk2基因与肝癌的发作、开展有关。进一步的研讨还显现，Pyk2阳性表达还与病理分级、肿瘤分解、血管侵袭及TNM分期密切相关，提示Pyk2能在肝癌细胞分解、侵袭搬运进程中发挥重要效果。
Twist不仅在胚胎形状发作中起要害调控效果，还参加调控肿瘤细胞增殖分解、侵袭搬运等进程[12]。胰腺癌中Twist高表达，而且与肿瘤分期、侵袭搬运密切相关[13]。结直肠癌中也存在Twist高表达，而且缄默沉静Twist基因后结直肠癌细胞增殖及搬迁力显着下降[14]。本研讨成果显现，Twist在肝癌安排中的表达率显着高于癌旁肝安排（P<0.05），而且Twist阳性表达还与病理分级、肿瘤分解、血管侵袭及临床TNM分期有关（P<0.05），提示Twist在肝癌侵袭搬运进程中发挥重要效果。Twist在低分解、中晚期的肝癌中的表达显着增强，进一步支撑了Twist参加肝癌恶性开展，这与车娜等[15]的研讨报导一起。相关性剖析显现，Pyk2与Twist在肝癌中的表达到正相关（P<0.05），提示Pyk2与Twist一起参加了肝癌恶性侵袭，估测Pyk2可能经过上调Twist促进了肝癌侵袭、搬运。
上皮间质转化是肿瘤细胞取得侵袭和搬迁才能的重要机制，当E-cadherin表达下调时，细胞间的黏附力下降，终究导致肿瘤细胞侵袭及搬运[16]。E-cadherin在甲状腺乳头状癌安排中低表达，其表达与临床分期及淋巴结搬运密切相关[17]。本研讨成果显现，E-cadherin在肝癌安排中的阳性表达率显着低于癌旁肝安排，E-cadherin阳性表达与病理分级、肿瘤分解、血管侵袭及TNM分期有关（P<0.05），提示E-cadherin与肝癌侵袭搬运密切相关。本研讨成果还显现，Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌安排中反常表达，而且三者密切相关，提示Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌侵袭搬运进程中发挥了协同效果。
综上所述，肝癌安排中存在Pyk2、Twist及E-cadherin反常表达，其一起参加了肝细胞的癌变及恶性侵袭搬运进程。Pyk2可能为肝癌的确诊和医治供给一个新的分子靶点。
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（收稿日期：2016-12-26 本文修改：祁海文）
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