陈江湖++++++郑晓春++++++李荣钢++++++涂文劭
[摘要] 意图 评论无创肢体缺血预处理快速相与推迟相叠加对大鼠皮瓣缺血再灌注（IR）损害的影响。 办法 挑选200～300 g健康雄性SD大鼠48只，将其随机分红单纯IR组、快速相（EPC）组、推迟相（DPC）组、EPC与DPC叠加（EDPC）组，每组各12只。经过试验规划树立动物模型，调查比照各组皮瓣IR后血清LDH、MDA、GSH-Px、SOD改变状况以及皮瓣存活率。 成果 EDPC组的MDA、LDH含量显着低于其他3组（P<0.05），而GSH-Px、SOD及皮瓣成活率显着高于其他3组（P<0.05）。 定论 无创肢体缺血预处理快速相与推迟相叠加对大鼠IR皮瓣具有维护效果且优于单一的快速相或推迟相的效果。
[关键词] 肢体缺血预处理；快速相；推迟相；缺血再灌注；皮瓣；大鼠
[中图分类号] R743.31 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0009-04
无创肢体缺血预处理（noninvasive limb ischemic preconditioning，NLIP）是指经过上肢或下肢、单侧或双侧的短时刻缺血预处理然后减轻远隔安排器官的缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）损害。现在研讨以为，NLIP对大鼠的许多脏器具有切当的前期和推迟维护效果[1-3]，即快速相（early preconditioning，EPC）和推迟相（delayed preconditioning，DPC）。EPC主要是因为缺血、缺氧等直接剌激机体开释腺苷等维护性介质[4-5]，其维护效果在预处理后数分钟内呈现，继续2～3 h，而DPC主要是NLIP激活杂乱的信号传递链，终究导致心脏维护基因翻译的添加[6-7]，其维护效果在预处理12～24 h呈现，效果强度弱，但时刻继续3～4 d。EPC和DPC的效应特色及机制不尽相同，特别是发生时刻不同，本研讨经过在大鼠NLIP24 h后再施加1次NLIP，完结大鼠NLIP的EPC效应和DPC效应堆叠，评论两时相叠加对大鼠IR皮瓣的维护效果。
1 材料与办法
1.1 试验动物和分组
200～300 g健康雄性SD大鼠48只，体重在270～330 g，由福建医科大学动物试验中心供给，在福建省立医院动物试验室分笼喂食，每笼4只，每天给予规范饲料，清洁自来水自在饮用。动物房环境温度22～24℃，相对湿度70%左右，试验前养殖1周以了解环境。
1.2 试验分组
将一切动物按体重进行编号，依据随机数字表法随机分红4组，每组12只。单纯IR组：别离皮瓣并施行缺血6 h/再灌注8 h（IR）处理，但未进行NLIP；快速相（EPC）组：施行阻断/敞开右后肢血流各5 min接连3次循环（NLIP），30 min后立即对皮瓣施行IR处理；推迟相（DPC）组：施行NLIP24 h后对皮瓣施行IR处理；快速相与推迟相叠加（EDPC）组：施行NLIP24 h后再施行1次NLIP，30 min后对皮瓣施行IR处理。
1.3 肢体缺血预处理（LIP）模型的树立
参阅张连元等[8]的办法，多功用监护仪监测大鼠右后肢脉息波，将环绕了橡皮筋的塑料管套入大鼠右后肢并尽量面向后肢根部，然后将橡皮筋从管上退下。因为橡皮筋的弹性回缩，会紧紧地结扎在大鼠右后肢根部，压榨了股动脉而阻断右后肢血流，当大鼠右后肢缺血5 min后，剪断橡皮筋康复右后肢血流灌注5 min。以监护仪显现的右后肢脉息波消失为阻断血流成功，以脉息波康复为血流康复。如此重复施行肢体IR 3个循环为1次NLIP。
1.4 皮瓣IR模型的树立
按Petry等[9]描绘的办法，术前禁食6 h，自在饮水。选用腹腔内打针10% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉，取仰卧位固定于试验台上，腹部去毛，于左下腹规划1个以腹壁浅血管为蒂的轴形皮瓣，巨细为6 cm×3 cm。充沛游离腹壁浅血管至其在股动静脉发出点，游离发出点近端的股动静脉，原位缝合皮瓣备用。因腹壁浅血管极细微，极易被手术器械损害，依据Petry等[9]的描绘，本研讨用无损害血管夹阻断腹壁浅血管的近端血管股动静脉血流，形成腹壁浅血管分配皮瓣的缺血，在缺血期间每2小时按0.15 ml/100 g腹腔内追加打针10%水合氯醛以保持大鼠麻醉状况。6 h后松开止血夹康复血流灌注8 h完结1次IR。以监护仪显现的左后肢脉息波消失为阻断血流成功，以脉息波康复为血流康复。
1.5设备与试剂
PM9000型多功用监护仪（迈瑞医疗世界公司），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测验盒、丙二醛（MDA）测验盒、乳酸脱氢酶（LDH）测验盒、总超氧化物歧化酶（SOD）测验盒，以上测验盒均由南京建成生物工程研讨所供给。
1.6 血清酶学检测
每试验组随机抽取6只大鼠在IR后立刻经颈内动脉抽取3～5 ml血液，放37℃恒温箱静置1 h后，3000 r/min，离心5 min，别离血清进行检测。严厉依照产品阐明书操作，检测血清LDH、MAD、SOD、GSH-Px。
1.7 皮瓣成活率检测
其他6只大鼠在IR后第7 天，用数码相机进行皮瓣照相后，运用Image-Pro Plus 6.0图画剖析体系核算皮瓣成活率：皮瓣成活率（%）=皮瓣成活面积/皮瓣总面积×100%。皮瓣坏死规范：皮瓣色泽变黑、外表黑色结痂，质地坚固，弹性消失，切开安排不出血。
1.8 统计学办法
数据选用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量材料以均数±规范差（x±s）标明，选用单因素方差剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 4组血清GSH-Px和SOD生机、MDA和LDH含量的比较
与IR组比较，EPC、DPC、EDPC组的GSH-Px和SOD生机均升高，血清LDH、MDA含量均下降（P<0.05或P<0.01）；其间，EDPC组的GSH-Px和SOD生机最高（P<0.05），其次为EPC组；EDPC组的血清LDH、MDA含量最低（P<0.05），EPC组略低于DPC组（P>0.05）（表1）。
表1 4组血清GSH-Px和SOD生机、MDA和LDH含量的
比较（x±s，n=6）
与IR、DPC组比较，*P<0.05，与IR、EPC、DPC组比较，#P<0.05
2.2 4组皮瓣成活率的比较
EDPC组的皮瓣成活率[（84.30±7.53）%]显着高于其他3组（P<0.05或P<0.01），而IR组的皮瓣成活率[（31.69±15.19）%]最低（P<0.01），EPC组[（69.41±11.53%）]虽略高于DPC组[（67.23±10.50）%]，但差异无统计学含义（P>0.05）（图1）。
3 评论
1986年Murry等[10]在心脏试验中发现时刻短的心肌缺血可以对随后长时刻缺血的心肌起维护效果，并把这一现象命名为缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC），尔后IPC在动物试验和临床上不断得到证明，但这种直接在脏器上进行的IPC不只操作困难，一起也是对脏器的一种损害，1996年Gho等[11]发现将小肠或许肾脏缺血15 min，对冠状动脉阻闭60 min的心肌也有维护效果，可显着缩小心肌梗死面积，这一发现将IPC的维护效果从同一器官延伸到不同器官，标明IPC是机体对缺血性损害的全体性反响，而不是限制性反响。现将这种非直接对IR损害的器官或安排进行IPC的方法称为长途缺血预习惯（remote ischemic preconditioning，RPC）。Oxman等[12]在1997年研讨发现下肢IPC后对IR的心肌亦具有维护效果，这一现象相同归于RPC的一部分，但因对肢体进行的IPC，具有更简洁，无创的特色，故又被称之为NLIP，其可经过对非重要脏器的时刻短缺血而减轻重要生命器官的IR损害，且操作简略易行，具有较大的临床使用价值。2002年Küntscher等[13]经过调查IR后大鼠腹部皮瓣，发现LIP亦能显着改进皮瓣的成活率，尔后，皮瓣IR模型因制备简略，逐步成为研讨LIP特色及机制最简洁、最常用的动物模型。
既往研讨标明，IPC的维护效果存在两个时相：EPC和DPC。EPC在预处理后数分钟内呈现，维护效果较强，只继续2～3 h，而DPC在预处理12～24 h呈现，效果强度弱，但时刻继续3～4 d，因此具有更重要的临床含义。2005年Loukogeorgakis等[14]报导RPC对人体内皮IR损害可发生前期和晚期阶段的维护效果，阐明RPC的维护效果也具有快速相和推迟相两个时相，两时相呈现时刻相距12～24 h。本研讨经过两次相距24 h的NLIP完结LIP快速维护效果和推迟维护效果的堆叠，试验发现EPC与DPC叠加处理后皮瓣的成活率显着比独自的EPC、DPC高，标明NLIP的EPC与DPC完结了叠加，并发生了强于独自EPC或DPC的维护效果。
IR和氧化应激密切相关，LIP机制中减轻远隔脏器氧源损害是一个重要方面，本研讨也在氧化/抗氧化机制方面进行评论。IR损害导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）等氧自在基很多发生，抗氧化酶如GSH-Px和SOD等的活性下降，安排中脂质过氧化严峻，MDA含量添加。LDH存在于一切安排细胞中，是参加糖无氧酵解的重要酶，在IR损害过程中，LDH作为损害目标能反映安排细胞的受损程度。本研讨中EPC、DPC组的大鼠血清GSH-Px、SOD的生机显着高于IR组，而LDH和MDA的含量显着下降，标明EPC、DPC均能有用进步机体铲除氧自在基的才能，维护安排细胞膜结构和功用的完好，此成果与既往的很多研讨类似，而本研讨中的EDPC组大鼠血清的GSH-Px、SOD的生机显着高于EPC、DPC、IR组，而LDH和MDA的含量亦显着低于其他3组，进一步证明两次距离24 h的NLIP能完结快速维护效果和推迟维护效果的叠加，能更有用进步机体铲除氧自在基的才能，发生更强的维护效果。EPC主要是因为缺血、缺氧等直接剌激机体开释腺苷、一氧化氮、缓激肽、去甲肾上腺素等介质及诱发神经反射[4-5，15]，经过扩张血管、铲除自在基、按捺炎症反响等机制起到维护心肌的效果，而DPC主要是IPC诱导了一氧化氮组成酶、环氧合酶-2、抗氧化酶和热休克蛋白等维护性蛋白质的组成，经过激活杂乱的信号链而触发预习惯，终究导致心脏维护基因翻译的添加[6-7，16]。本研讨以为EPC与DPC的效果机制不同，且EPC起效仅需数分钟，在DPC起效，即维护性蛋白质组成后，第2次的NIPC可影响机体再次敏捷开释维护性介质及诱发神经反射，经过扩张血管、铲除自在基及按捺炎症反响等机制进一步加强维护效果，然后完结快速维护效果和推迟维护效果的叠加，发生更强的维护效果。
综上所述，NLIP的EPC与DPC能完结叠加，且两时相叠加后对皮瓣的维护效果显着优于单纯EPC或DPC，但其效果机制仍未清晰，有待进一步研讨证明。
[参阅文献]
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（收稿日期：2014-08-14 本文修改：许俊琴）
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（收稿日期：2014-08-14 本文修改：许俊琴）
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